Vps37a通过控制胰高血糖素受体定位来调节肝脏葡萄糖的产生
点评理由：胰高血糖素受体（Gcgr）在调节葡萄糖和脂质代谢中起着关键作用，但不同的信号差异调节的机制仍不清楚。该研究发现内体蛋白Vps37a通过改变细胞内受体定位，通过cAMP/PKA/p-Creb信号通路影响葡萄糖产生与Gcgr信号下游的脂质利用。研究发现可用于治疗2型糖尿病。
肝葡萄糖生成（HGP）是全身葡萄糖稳态的关键生理过程。胰高血糖素通过激活糖异生和糖原分解来刺激HGP，以维持正常血糖，这些途径的过度激活会导致空腹高血糖和胰岛素抵抗（IR）[1]。然而，精确控制HGP的细胞生物学机制仍不清楚。
胰高血糖素受体（GCGR）是一种B类G蛋白偶联受体（GPCR），是肝脏胰高血糖激素作用的主要调节器。通过与质膜（PM）上的胰高血糖素结合激活复杂的信号级联反应，其中Gαs亚基通过激活蛋白激酶a（PKA）/cAMP响应元件结合蛋白（CREB）信号通路，启动cAMP介导的糖异基因、葡萄糖-6-磷酸酶（G6PC）和磷酸烯醇丙酮酸激酶（PCK1）的诱导。此外，Gαq亚单位通过磷脂酶Cε（PLCε）介导的三磷酸肌醇（IP3）生成发挥作用，并通过诱导依赖INSP3R1的钙从内质网流出到线粒体来刺激脂肪酸的β氧化[2]。尽管经典观点认为GPCR激活的信号仅发生在PM，但现有证据表明，在不同的细胞内隔室中，A类GPCR的G蛋白信号揭示了信号调节的额外复杂性。在外部配体结合时，GPCR被GPCR激酶磷酸化，GPCR激酶募集胞质β-arrestins，导致受体内化到内体，用于溶酶体降解[3]。对于代谢相关的B类GPCR（如Gcgr）是否同样适用尚不清楚。
近日，由德国糖尿病和癌症研究所的Anja Zeigerer领衔的研究团队在《Cell Metabolism》期刊发表重要研究成果，他们发现内体蛋白Vps37a通过改变细胞内受体定位，使葡萄糖产生与Gcgr信号下游的脂质利用分离。肝细胞特异性沉默Vps37a导致Gcgr在内胚体中积累，导致cAMP/PKA/p-Creb信号通路过度激活，导致糖异生，而不影响β氧化。该研究揭示了体内信号传导对代谢疾病的贡献，可用于治疗2型糖尿病。
鉴于ESCRT-I机制在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）进展中的拟议作用[4]，他们研究了ESCRT-I成分在肝脏代谢调节中的作用。ESCRT-I是一种异四聚体复合物，包括肿瘤易感基因101（Tsg101）、Vps28、Vps37（a-d）等。他们发现VPS37A的表达在严重NAFLD患者中显著降低（43%），而TSG101和VPS37C在NASH患者中仅分别出现轻微降低或增加（图1A-1C），而VPS28和VPS37B未受影响。这些数据表明VPS37A在NAFLD中具有特殊作用，低水平的VPS37A与肝脏健康受损相关。由于NAFLD的严重程度通常与T2D发病率的增加有关，他们在肥胖和T2D患者队列中筛选了ESCRT-I的表达，与健康对照组相比。与第一个患者队列一致，肥胖和T2D患者的VPS37A表达与VPS37B一起显著降低（56%，图1D），而其他ESCRT-I成员没有改变。这些数据强调了VPS37A表达水平与代谢受损的负相关性，表明VPS37A在T2D和NAFLD中起着关键作用。
为了探索Vps37a的代谢作用，他们通过尾静脉注射含有Vps37a-siRNA的脂质纳米粒子（LNP），在小鼠肝细胞中体内沉默（KD）Vps37a。在丙酮酸盐和甘油耐受性试验期间，Vps37a的降低导致HGP显著增加（图1E），表明Vps37a在HGP中具有优先作用。体内Vps37a KD后，糖异生酶G6Pase和Pck1的mRNA和蛋白水平显著增加（图1F-1J），进一步支持葡萄糖生成的激活。糖异生的上调伴随着叉头转录因子XO1（Foxo1）和dGcgr表达的增加（图1F）。他们进一步地研究了Creb的磷酸化，已知Creb可诱导糖异基因的转录激活。有趣的是，他们在Vps37a耗尽的肝脏中观察到基础p-Creb显著增加（图1I和1J），这与糖异生基因上调一致。
图1 肝脏中Vps37a的消耗导致葡萄糖生成增加
为了测试Vps37a是否调节胰高血糖素反应性，他们对小鼠进行了胰高血糖激素刺激试验。Vps37a KD小鼠在胰高血糖素刺激后30-60分钟血糖水平升高（图2A），表明胰高血糖激素诱导的HGP活化增加。这在原代小鼠肝细胞中得到证实（图2B）。与胰高血糖素信号的过度激活和随后肝脏中糖原分解的启动一致，肝糖原含量显著降低（图2C）。由于Vps37a KD已经导致基础p-PKA底物和p-Creb增加，他们想知道胰高血糖素刺激是否可以进一步增强这种诱导作用。事实上，胰高血糖素治疗诱导原代肝细胞中p-PKA底物和p-Creb水平更大的增加（图2D-2G），这表明Vps37a耗竭启动了胰高血糖素向更强反应的信号传导。一致的是，胰高血糖素刺激进一步增加了Vps37a耗尽的肝细胞中G6pc和Pck1的表达（图2H和2I）。胰高血糖素信号的激活对cAMP/PKA/p-Creb途径是特异性的，因为他们没有观察到体内胰高血糖激素刺激后AMP激活的PK（AMPK）或乙酰辅酶A羧化酶（ACC）磷酸化的变化（图2J、2K）。此外，体外肉碱棕榈酰转移酶1α（Cpt1α）基因表达无变化（图2L）。这与ATP水平不变一致（图2M），表明Vps37a KD诱导cAMP不足以激活AMPK。
尽管在胰高血糖素刺激下，PLCε从PM到胞质溶胶的易位减少了20%（图2N和2O），但这种减少对下游钙/钙调素依赖性PK II型（CaMKII）的磷酸化水平没有影响，这与受体所占比例而非蛋白质水平对信号效力很重要的事实一致[5]。重要的是，他们在Vps37a KD后观察到肝脏和血脂参数没有变化，表明Gcgr信号对脂质代谢没有改变。这些结果表明Vps37a的缺失激活了胰高血糖素介导的cAMP/PKA/p-Creb信号传导，导致随后糖异生和HGP的选择性增加，而不改变脂质稳态。
图2 Vps37a KD导致胰高血糖素信号过度激活
肝脏中负责p-Creb的cAMP依赖性激活和伴随的糖异生诱导的主要信号通路由Gcgr调节[6]。因此，观察到的Vps37a KD诱导cAMP/PKA/p-Creb通路表明Vps37a在Gcgr信号传导中的潜在作用。为了确定Vps37a的代谢作用是否依赖于Gcgr，他们从肝特异性Gcgr敲除（KO）小鼠（Gcgr-/-liver）中分离原代肝细胞，并分析Vps37a KD是否能激活糖异生。在杂合Gcgr-/-liver中Gcgr-KO肝细胞Vps37a降低50%可诱导胰高血糖素刺激的p-Creb活化以及G6pc和Pck1表达增加，但纯合Gcgr-/-liver并没有（图3A-3C），证实了Gcgr依赖性。
为了评估在Vps37a KD上观察到的葡萄糖生成增加是否也依赖于体内的Gcgr，他们使用Gcgr拮抗剂IUB396抑制了胰高血糖素诱导的原代小鼠肝细胞p-Creb活化。有趣的是，在丙酮酸刺激前腹腔内注射IUB396完全阻断了Vps37a降低后HGP的增加（图3D和3E），支持了Vps38a KD的代谢作用通过Gcgr发生的观点。
图3 Vps37a通过Gcgr调节cAMP/p-Creb信号
由于HGP的过度激活是T2D的标志，他们测试了Vps37a KD下对葡萄糖输出的刺激作用是否会表现为代谢受损状态。他们通过每两周注射一次LNP来降低喂养高脂饮食（HFD）小鼠的Vps37a，有趣的是，在HFD 13周时，Vps37a KD小鼠出现了增强的高血糖（图4A），这表明Vps37a KD对HGP的刺激作用导致葡萄糖稳态的进一步失衡。事实上，HFD喂养的Vps37a KD小鼠表现出比对照组更差的葡萄糖不耐受（图4B），同时AUC更高（图4C），IR水平的稳态模型评估也增加（图4D）。
为了了解Vps37a KD对葡萄糖稳态的影响是否与胰岛素敏感性降低有关，他们检查了胰岛素注射后肝脏、肌肉和脂肪组织中p-AKT的激活。事实上，HFD下Vps37a的长时间降低导致胰岛素诱导的p-AKT活化减少，表明肝脏和外周IR的诱导（图4E-4J）。与Vps37a KD在野生型小鼠中的作用一致，他们观察到对照组和Vps37a KD和HFD喂养小鼠中p-PKA底物和p-Creb的丰度增加（图4K和4L）。这些结果表明，Vps37a的耗竭通过过度激活肝脏PKA/Creb信号而诱导高血糖并降低葡萄糖耐量，从而突出了Vps37a对HFD喂养小鼠葡萄糖稳态维持的贡献。
图4 HFD小鼠中的Vps37a KD诱导高血糖而不改变脂质代谢
Vps37a作为ESCRT-I的成员，参与将泛素化膜受体导向溶酶体进行降解，这个角色需要整个复合体的功能完整。为了测试Vps37a KD的作用是否通过失稳ESCRT-I介导，他们测量了其他复合物成员的丰度。有趣的是，Vps37a KD诱导的Vps37c蛋白水平降低了50%，而Vps37b略有降低，观察到的变化是由于蛋白质周转，因为所有ESCRT-I成员的mRNA水平未受影响（图5A-5C）。相比之下，Tsg101的KD导致Vps37a蛋白水平降低（图5D和5E）。这些数据表明，Vps37a的代谢作用与ESCRT-I稳定性无关。
由于Vps37a似乎调节早期到晚期的内体运输，并且其代谢作用是Gcgr依赖性的，他们假设Vps37a在Gcgr运输和信号传导中起作用。为了研究Gcgr的细胞内分布和转运，他们开发了一种荧光Cy5胰高血糖素激动剂，使其能跟踪内源性表面并用Cy5胰高血糖素内化Gcgr。为了研究Vps37a是否参与Gcgr转运，他们分析了随着时间的推移，Vps37a与Cy5胰高血糖素在原代人肝细胞中的共定位。有趣的是，Cy5胰高血糖素内化1小时导致标记的胰高血糖激素与VPS37A共定位25%，2小时后降低（图5F和5H）。基于与LAMP1的共定位，这种减少与溶酶体中其丰度增加高达60%有关（图5G和5I），表明其在后期时间点的降解增强。引人注目的是，他们发现在胰高血糖素刺激条件下，Vps37a与Gcgr有特异性相互作用（图5J）。总之，这些数据有力地支持了Vps37a通过与受体相互作用介导Gcgr贩运的作用。
图5 Vps37a与Gcgr相互作用
为了测试Vps37a的丢失是否对Cy5胰高血糖素标记的Gcgr的细胞内分布有影响，他们测量了Vps37a KD上Gcgr的表面和内部池。值得注意的是，Vps37a的KD使PM Gcgr水平降低了40%（图6A和6B），并且基于6小时内连续摄取Cy5胰腺高血糖素，细胞内池增加了3倍（图6C和6D）。因此，Vps37a耗竭将受体定位转移到细胞内隔室。为了检验它们的身份，他们分析了Cy5胰高血糖素与内化EGF、Eea1、Lamp1和再循环内体标记物Rab11的共定位（图6E-6H）。有趣的是，Vps37a KD分别导致与EGF和Eea1的共定位增加40%和50%（图6I和6J），而与Lamp1的共定位减少60%（图6K），这与增强的内体和减少的溶酶体定位一致。令人惊讶的是，他们观察到Vps37a KD下Rab11阳性再循环内体的数量减少（图6H）。这些数据表明，Vps37a KD后，Rab11阳性内体中Gcgr的额外积累可能有助于受体表面表达的减少（图6L）。这些数据表明Gcgr在Vps37a KD上被延迟运输到溶酶体，导致其在早期和部分再循环的内体中的丰度增加。
图6 Vps37a KD导致Gcgr在内体中积累
总之，该研究确定了Vps37a和ESCRT-I在调节肝脏Gcgr信号中的生理作用，有可能在不影响脂肪酸氧化的情况下降低循环血糖水平。然而，他们的研究并没有解决这种变化的原因和后果。尽管引入Vps37a有可能降低循环葡萄糖水平，但它需要整个ESCRT-I复合物的集体功能。这表明ESCRT-I对代谢稳态的贡献更为复杂。此外，还需要进行研究以剖析Gcgr的细胞内贩运是如何被调控的，而不仅仅是Vps37a的作用。
参考文献
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